VALIDAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DA TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA – PAINEL DE SONDAS PARA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA

LISBOA, Mateus de Oliveira1; JAMUR, Valderez Ravaglio 3; REBELATTO, Carmen Lúcia Kuniyoshi 3; SENEGAGLIA, Alexandra Cristina 3; BORGONOVO, Tamara 3; BROFMAN, Paulo Roberto Slud2;

Resumo

Introdução:Métodos de citogenética molecular, como hibridização in situ com fluorescência (FISH), são mais sensíveis que a análise clássica de cromossomos metafásicos, porque podem detectar anormalidades específicas, tanto em células em divisão como em núcleos interfásicos, pequenas populações de células anormais ou alterações moleculares não detectadas pelos métodos citogenéticos convencionais. Entretanto, para o uso clínico, cada laboratório deve validar as sondas que serão utilizadas, estabelecendo o ponto de corte (cutoff) e verificando a especificidade e acurácia de cada uma delas.

Objetivo:Validar o painel de sondas de DNA, cen12 / TP53 / ATM / D13S319, utilizadas na técnica de FISH para o diagnóstico de leucemia linfocítica crônica (LLC), com a determinação do ponto de corte, sensibilidade e especificidade para cada uma delas, para a sua aplicação clínica.

Metodologia:Utilização da técnica de FISH em cinco amostras de sangue periférico heparinizado de indivíduos com a média de idade 23 (cinco homens e duas mulheres), cultivadas para obtenção de metáfases e analisadas também por citogenética convencional. As lâminas foram hibridizadas com o painel de sondas de DNA para LLC (marca Vysis Abbott Molecular), composto pelas seguintes sondas: LSI TP53 (Spectrum Orange) para o gene TP53 localizado em 17p13.1, LSI ATM (Spectrum Green) para o gene ATM localizado em 11q22.3, LSI D13S319 para detectar deleções em 13q14.3 (Spectrum Orange) e 13q34 (Spectrum Aqua), e CEP 12 (Spectrum Green) para enumerar o cromossomo 12. A contra coloração foi feita com o corante 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). O protocolo seguido foi o do fabricante, com adaptações. Foram analisados 1000 núcleos (200 de cada amostra) para a determinação do cutoff e 52 metáfases para verificar a colocalização e o cálculo da sensibilidade e especificidade. O valor de corte foi calculado por meio da função Beta Inv do software Microsoft Excel.

Resultados:Todas as amostras analisadas apresentaram os sinais esperados para as sondas utilizadas. O valor de corte foi de 3,1% para o ATM, 10,1% para o TP53, 2,3% para o cen12 e 1,5% para o D13S319. Os resultados da sensibilidade e especificidade foram de 100%. O número mínimo recomendado de células analisadas para o teste de FISH é 100, mas no presente estudo optamos por 200 células por amostra para aumentar a sensibilidade. O número de núcleos interfásicos analisados interfere no valor de corte calculado, por isso recomenda-se que sejam analisadas um total de 1000 células, assim como foi feito neste estudo.

Conclusões:A validação demonstrou alta especificidade e acurácia das sondas utilizadas o que proporcionou a utilização segura desse painel de sondas para o uso clínico na investigação de alterações genéticas na LLC.

Palavras-chave:Citogenética. FISH. LLC. Validação

Legendas

    1. Estudante
    2. Orientador
    3. Colaborador