EDIÇÃO GENÉTICA DA VARIANTE N551K DO GENE LRKK2 ATRAVÉS DE CRISPR/CAS9

GOMES, Ana Silvia de Lara Pires Batista1; MIRA, Marcelo Tavora2;

Resumo

Introdução:A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que afeta cerca de 210.000 pessoas a cada ano. A doença tem longo tempo de incubação, é causada pelo bacilo intracelular Mycobacterium leprae e gera danos nos nervos periféricos e pele. Diversos estudos têm evidenciado o papel da genética do hospedeiro na susceptibilidade e patogênese da doença. Dentre os genes estudados, o LRRK2 já foi associado com a hanseníase em populações etnicamente distintas. Uma etapa fundamental para elucidar o papel deste gene no impacto na doença é a investigação funcional de suas variantes. Um dos mecanismos possíveis para realizar tais análises é a CRISPR/Cas9, uma ferramenta de edição genética de alta especificidade. Neste estudo, a técnica foi utilizada para investigar a variante N551K do gene LRRK2 em fibroblastos primários de membros de uma família que apresentou duas gêmeas monozigóticas que desenvolveram precocemente hanseníase.

Objetivo:O objetivo deste estudo foi editar geneticamente o gene LRRK2 em células humanas obtidas de pacientes hansenianos que apresentaram fenótipo raro de hanseníase de início precoce. Especificamente, a proposta envolve a geração de células knock-in da variante N551K do gene LRRK2 nas células alvo do estudo.

Metodologia:Fibroblastos dos pacientes foram cultivados em meio DMEM suplementado com 10 % de SFB e 1 % de penicilina/streptomicina, e mantidos em estufa úmida a 37 °C, 5 % de CO2. Para a edição genética por CRISPR foram desenhados 3 gRNAs contendo 20 nucleotídeos através do software GeneArt CRISPR Search and Design Tool (Thermo Fischer Scientific), utilizando-se como parâmetros: (i) alinhamento inespecífico de no mínimo 3 nt e/ou (ii) presença de 2 mismatches na região seed (6 a 11 nucleotídeos adjacentes à sequência PAM). Os gRNAs desenhados foram obtidos através de transcrição in vitro e avaliados quanto a sua concentração em espectrofotômetro Nanodrop 2000. O DNA doador utilizado neste estudo foi desenhado no formato de uma fita simples de DNA (ssODN) com 140 nucleotídeos. A avaliação da qualidade dos guias foi realizada em eletroforese em gel de agarose 1-2 % e a quantificação foi feita com a utilização do Nanodrop. A entrega do sistema CRISPR ocorreu utilizando a técnica de complexo ribonucleoproteico (RNP) por eletroporação ou transfecção química. Por fim, a triagem das células editadas foi feita através do ensaio enzimático com T7 endonuclease.

Resultados:Os gRNAs foram obtidos e testados em géis que comprovaram sua correta obtenção. Os guias apresentaram valor de concentração de 1970,2 ng/µL e o valor das razões obtido estava dentro dos parâmetros para RNA, próximo de 2,0 para 260/280 e entre 2,0-2,2 para razão 260/230. A entrega do sistema CRISPR/Cas9 foi realizada, no entanto não houve detecção de células editadas geneticamente.

Conclusões:A análise da edição genética por CRISPR/Cas9 dos fibroblastos primários apontam para uma baixa eficácia na obtenção de clones editados, possivelmente devido ao lento crescimento dos fibroblastos, indicando a senescência destas células. Métodos alternativos estão sendo testados atualmente no laboratório.

Palavras-chave:Hanseníase. LRRK2. N551K. CRISPR/Cas9

Legendas

    1. Estudante
    2. Orientador