EDIÇÃO GENÉTICA DA VARIANTE R1398H DO GENE LRRK2 ATRAVÉS DE CRISPR/CAS9

SANTOS, Andressa Mayra dos1; MIRA, Marcelo Tavora2;

Resumo

Introdução:A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae, que afeta a pele e o sistema nervoso periférico. Sabe-se que a maior parte da população exposta ao patógeno não desenvolve a doença, sugerindo assim a existência de um forte componente genético controlando a susceptibilidade do hospedeiro à hanseníase. Um estudo recente de nosso grupo de pesquisa identificou o gene LRRK2 como candidato causal de fenótipo extremo de hanseníase precoce em uma família do Piauí. Estudos funcionais são necessários para se avançar no entendimento do papel das variantes do gene LRRK2 no controle de fenótipos da doença; para se atingir este objetivo, técnicas de edição genética começam a ser empregadas pela comunidade científica.

Objetivo:Editar geneticamente o gene LRRK2 em células humanas obtidas de pacientes hansenianos que apresentaram hanseníase de início precoce, gerando células knock-in da variante R1398H deste mesmo gene nas células primárias em estudo.

Metodologia:Foram realizadas biópsias de pele para a obtenção de fibroblastos a serem editados por CRISPR/Cas9. Estas células foram cultivadas em DMEM com a adição de 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico. Os guias de RNA foram desenhados através da ferramenta GeneArt CRISPR Search and Design Tool da Thermo Fischer Scientific e obtidos através do kit GeneArt Precision gRNA Synthesis da Thermo Fischer Scientific. A síntese do DNA doador foi realizada na forma de DNA de fita simples (ssODN), sendo removida a sequência PAM e adicionado um sítio de endonuclease para a triagem de células editadas. A tranfecção dos componentes (gRNA, ssODN e Cas9) foi realizada em dois padrões de eletroporação e três condições de transfecção química. Para verificação de edição gênica foi realizado o ensaio de T7 endonuclease.

Resultados:A ausência de bandas de clivagem após o ensaio enzimático sugeriu baixa eficiência de edição genética, provavelmente devido à lenta taxa de crescimento dos fibroblastos primários utilizados.

Conclusões:A edição por CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para nocautear genes ou alterar mutações de único nucleotídeo, devido principalmente à sua facilidade de manipulação e custo. Os resultados obtidos neste estudo sugerem a utilização de técnicas alternativas de edição genômica, atualmente em implementação no grupo de pesquisa.

Palavras-chave:Hanseníase. CRISPR/Cas9. Edição genética. LRKK2

Legendas

    1. Estudante
    2. Orientador