CLONAGEM DE GRNAS-LRRK2 NO VETOR PX458 PARA EDIÇÃO GENÉTICA DO GENE LRRK2 ATRAVÉS DE CRISPR/CAS9

CASTRO, Maria Luiza de1; CASTRO, Maria Luiza de 3; MIRA, Marcelo Távora 3; PHD3; CAMBRI, Geison 3; PHD3; CAMBRI, GEISON2;

Resumo

Introdução:A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que atinge pele e nervos periféricos. Causada pelo bacilo intracelular Mycobacterium leprae, ainda que curável, apresenta mais de 200 mil novos casos por ano em todo o mundo. Ao longo das últimas décadas, estudos genéticos formaram um sólido copo de evidência demonstrando o impacto de genes e regiões genômicas para o controle da infecção, manifestações clínicas e progressão da hanseníase. Entre os genes descritos como associados como moduladores de suscetibilidade do hospedeiro, encontra-se o gene LRRK2. Como próxima etapa aos estudos genéticos, os estudos funcionais são necessários para comprovar a participação destes genes no controle de susceptibilidade à doença. A investigação funcional desses genes pode ser explorada com auxílio do sistema CRISPR/Cas9, para através de edição genômica, investigar o efeito de variantes genéticas em células de um mesmo individuo

Objetivo:Clonar gRNAs em vetor pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) para a edição genética do gene LRRK2 através de CRISPR/Cas9 em células de pacientes hansenianos tratados que apresentaram hanseníase de início precoce.

Metodologia:Foram desenhados 2 RNAs guias (gRNAs), um para cada variante (N551K e R1398H), utilizando-se a plataforma GeneArt CRISPR Search and Design Tool (Thermo Fischer Scientific). Os gRNAs desenhados previamente foram adquiridos comercialmente como primers, sendo um primer forward e um primer reverse, sendo necessário anelar os dois para a formação do gRNA. O gRNA, no formato de um oligonucleotídeo, foi clonado no plasmídeo pSp-Cas9(BB)-2A-GFP (PX458) usando a estirpe de E. coli TOP10. Análises quantitativas e qualitativas do DNA plasmidial foram realizadas e então feito o sequenciamento para confirmação da clonagem dos gRNAs.

Resultados:A transformação do vetor PX458+gRNAs foi observada pela presença de colônias bacterianas crescidas em meio contendo ampicilina, o antibiótico de seleção do plasmídeo. Nas análises qualitativas destes gRNAs todos apresentaram razão 260/280 e 260/230 próximas a 2,0, demonstrando níveis adequados de qualidade para esse DNA. Ademais a observação da migração em gel de agarose confirmou o tamanho esperado para o plasmídeo clonado. Após sequenciamento, foi possível identificar a presença dos gRNAs, o que mostra que a clonagem foi eficiente e que, portanto, o plasmídeo gerado poderá ser utilizado em estudos futuros. A eletroporação dos plasmídeos não foi realizada, conforme previsto pelos objetivos iniciais deste estudo, pois as células alvo entraram em senescência.

Conclusões:O presente estudo gerou plasmídeos contendo sequências de RNAs guia (gRNA) a serem utilizados na edição genética das variantes N551K e R1398H do gene LRRK2. Ainda que não tenha sido possível cumprir com um dos objetivos específicos, os plasmídeos aqui construídos serão utilizados para a edição genética de células pluripotentes induzidas (iPS).

Palavras-chave:Hanseníase. LRRK2. CRISPR. DNA recombinante

Legendas

    1. Estudante
    2. Orientador
    3. Colaborador